总理谈台湾问题：两岸同胞说到底是一家人

怎么办呢？只能想方设法去找那些愿意接受新鲜事物的年轻人，尤其是那些有理工科背景的科技控。

什么是计算生物学计算生物学是指开发和应用数据分析及理论的方法、数学建模、计算机仿真技术等。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

有参考基因组重构，是指先将read贴回到基因组上，然后在基因组通过reads覆盖度，junction位点的信息等得到转录本，常用工具包括scripture、cufflinks。如果是Pair-end测序，分别从一个片段的3，5端进行测序，会产生两个Reads。基因组印记病主要表现为过度生长、生长迟缓、智力障碍、行为异常。什么是基因组学基因组学（英文genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。终止点由反应中相应的双脱氧而定。

相对于传统单个细菌研究来说，它具有众多优势，其中很重要的两点：(1) 微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的，因此做Metagenomics研究比做单个个体的研究更能发现其特性。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2与3不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应，ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，DNA合成反应便会终止。

但伴随着qPCR技术的迅猛发展，有关这项技术的质量管理问题也日益突出，如何消除各类生物学变量所引起的检测变异，减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。对于变异纯合子而言，HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定，但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。由于其超高的特异性与成功的商品化推广，Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法，其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。如何利用DNA构象对序列进行推测，从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。

(一)DNA印迹技术(Southernblot)Southern于1975年发明了DNA印迹技术，通过限制性内切酶将DNA片段化，再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离，通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交，经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升：即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化，操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化。

该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上，只需通过1次杂交反应，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。由于荧光报告原理不同，其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。(三)高分辨率熔解分析(high-resolutionmelting analysis，HRMA)2003年，Wittwer等首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记，再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。然而，由于该技术需要对DNA进行片段化处理，测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp)，需要对数据进行大规模拼接，因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求，以利于后期的测序数据分析。

随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR GreenI进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验，但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测，因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。(三)第3代测序第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。时至今日，芯片技术已经得到了长足的发展，如果按结构对其进行分类，基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。

基于这一理念，Vgelstein与Kinzter于1999年发表了数字PCR(digitalPCR)的方法，对结肠癌患者粪便中的微量K-RAS基因突变进行了定量。二、核酸序列测定测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段，是分子诊断技术的一项重要分支。

在MLPA反应中，2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，再使用连接酶连接2部分探针。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，便可对把核酸序列进行检测。

该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、PacificBiosciences公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies公司的纳米孔技术等。盘点：分子诊断常用技术50年的沿革与进步 2015-10-23 06:00 · brenda 半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交，使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪，其中红色激光检测微球编码，绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度，一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。当PCR反应开始后，茎环结构在变性高温条件下打开，释放荧光;在退火过程中，靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性，不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭，通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度，便可以real-timePCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。相比于Taqman探针，分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合，大大降低了检测的荧光背景，其检测特异性较Taqman探针更高，更适合等位基因的分型检测。

正是由于上述技术优势，qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术，在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测，在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。

(二)第2代测序1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念，Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。2.Taqman探针由于双链掺入法存在特异性较低的问题，1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。

通过在质粒载体导入单碱基突变的方法，构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide，ASO)，更使对核酸序列点突变的检测成为可能。经过PCR后，对每个微反应孔的荧光信号进行检测，存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号，没有靶模板的反应孔就没有荧光信号，以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。

(三)荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization，FISH)FISH源于以核素标记的原位杂交技术，1977年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。随着技术的不断进步，目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测，可快速检出5%负荷的变异序列。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理，MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。

通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上，使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。通过比较基因组杂交(comparativegenomic hybridization，CGH)与光谱核型分析(spectralkaryotyping，SKY)等FISH衍生技术，使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。

1.微阵列芯片(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-basedgenomic DNA profiling，MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史，其技术平台主要分为2类，即微阵列比较基因组杂交(array-basedcomparative genome hybridization，aCGH)和基因型杂交阵列(SNParray)。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。

但需注意的是，由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测，其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。(一)实时荧光定量PCR(real-timePCR)1.双链掺入法1992年Higuchi等通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定，提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线，定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-timePCR)模型，开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。

该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。随着技术的进一步发展，传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学，也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。连接反应完成后，用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针，每个探针扩增产的长度都是唯一的。检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。

五、对未来5年的展望半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。(二)变性高效液相色谱(denaturinghigh-performance liquid chromatography，dHPLC)1997年，Oefner和Underhill建立了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术，称为dHPLC，可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。

其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测，Saiki[4]又发明了ASO-RDB，通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分型、基因突变的检测。待测样本经PCR扩增后，若存在序列变异杂合子，则形成异源双链，其熔解温度大大下降。

但需要注意的是，由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证，因此其只适合大规模的初筛，而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入，分子诊断将会出现理念的革命性进步，高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。